引物優(yōu)化設(shè)計

　　良好的引物探針設(shè)計是數(shù)字PCR實驗獲得成功的關(guān)鍵因素之一。這正是眾多研究人員選擇LNA（鎖核酸技術(shù)）的原因——LNA修飾的引物和探針采用了成熟可靠的算法設(shè)計，獲得了科學(xué)家的信賴。

　　使用不合適的引物可能會引入引物二聚體、非特異性擴增等，進(jìn)而影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。在此，小Q建議您在設(shè)計引物時需做以下幾個方面的檢查，需對設(shè)計好的引物進(jìn)行BLAST比對分析，以確保引物的特異性！

　　在數(shù)字PCR定量實驗中，對于基因突變檢測、基因表達(dá)差異分析和拷貝數(shù)變異鑒定等對實驗性要求較高的實驗，需要特異性更高的Assay。QIAGEN基于QIAcuity數(shù)字PCR平臺開發(fā)并驗證了針對上述常見應(yīng)用的700多組dPCRLNAAssay，所有Assay均經(jīng)過鎖核酸修飾來增強其對互補序列的親和力和特異性，進(jìn)而提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　鎖核酸技術(shù)優(yōu)勢

　　樣品制備

　　值得注意的是，在gDNA長度≥20kb或進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測實驗時，必須對樣品進(jìn)行酶切處理，確保大片段DNA序列或串聯(lián)序列在酶切處理后，模板隨機且均勻的進(jìn)入獨立反應(yīng)體系，以實現(xiàn)準(zhǔn)確和精確的定量。

　　建議酶切位點

　　數(shù)字PCR實驗離不開包含有Mg2+、dNTP、Buffer和DNA聚合酶等PCR反應(yīng)所需要的MasterMix。隨著實驗的不斷深入，對于實驗條件的要求也不斷提高，其中DNA聚合酶對實驗的準(zhǔn)確性起著至關(guān)重要的作用。由于非熱啟動的DNA聚合酶在反應(yīng)體系易使引物在室溫條件下發(fā)生非特異性擴增，直接影響實驗結(jié)果。為確保實驗順利進(jìn)行，QIAcuityEGPCRKit和ProbePCRKit均采用抗體修飾的熱啟動DNA聚合酶，利用小分子鎖扣(Guardmolecular)將DNA聚合酶與抗體緊密結(jié)合形成雙保險，使其室溫條件下失活，只有通過95℃高溫2分鐘才能開啟小分子鎖扣，激活DNA聚合酶活性，有效避免了非特異性擴增現(xiàn)象。

　　熱啟動DNA聚合酶技術(shù)

　　樣品分區(qū)微反應(yīng)單元體積大小一致且穩(wěn)定是泊松分布準(zhǔn)確計算的前提。樣本反應(yīng)液在進(jìn)行液滴分散過程中由于液體表面張力、操作不當(dāng)?shù)扔绊懀瑢?dǎo)致其部分發(fā)生融合和破裂。融合使液滴體積變大，破裂則導(dǎo)致有效分區(qū)數(shù)量變少更增加了交叉污染的風(fēng)險。因此，整個實驗過程需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行實驗操作。相較于液滴式分區(qū)，QIAcuity數(shù)字PCR搭配的Nanoplate采用納米微孔設(shè)計，利用微流體技術(shù)將數(shù)字PCR反應(yīng)體系分配到大小均一且固定微孔中，并在分區(qū)完成后自動封閉所有微孔聯(lián)通管道，真正意義上實現(xiàn)獨立均一的微反應(yīng)體系。

　　熱循環(huán)過程PCR擴增效率的高低直接影響終信號的判讀和實驗結(jié)果分析。在進(jìn)行熱循環(huán)實驗時，需檢查樣品的密封性以及PCR反應(yīng)板是否和PCR儀熱蓋*接觸，確保PCR過程中樣品反應(yīng)液沒有蒸發(fā)。QIAcuity數(shù)字PCR系統(tǒng)采用獨立的微反應(yīng)腔室封閉方式，固態(tài)的物理分割和封閉可有效避免PCR過程中微反應(yīng)體系的水分蒸發(fā)，確保微反應(yīng)體系中樣本反應(yīng)液濃度的恒定，更易實現(xiàn)準(zhǔn)確和精確的定量。

　　數(shù)據(jù)分析原始數(shù)據(jù)中往往發(fā)現(xiàn)陽性信號與陰性背景之間存在許多弱陽性信號。因此需要對引物探針進(jìn)行重新設(shè)計和優(yōu)化（詳見引物探針優(yōu)化設(shè)計）或提升退火溫度（探針通常比引物高5~10℃），以消除疑似熒光信號的“雨區(qū)“現(xiàn)象；此外，陽性信號和陰性背景間隙過小，導(dǎo)致終結(jié)果無法準(zhǔn)確判讀。因此需要調(diào)整引物探針濃度（建議總反應(yīng)體系引物濃度為600~800nM；探針濃度為200-400nM）或5'端前三個堿基如有G出現(xiàn)，則將其互補序列設(shè)計為實驗所用探針，以提高陰陽性信號間隙，便于分析結(jié)果的準(zhǔn)確判讀。